Մոլեկուլային ախտորոշում, սովորաբար օգտագործվող PCR տեխնոլոգիա և սկզբունք

ՊՇՌ, պոլիմերազային շղթայական ռեակցիան է, որը վերաբերում է dNTP, Mg2+, երկարացման գործոնների և ամպլիֆիկացման ուժեղացման գործոնների ավելացմանը համակարգին՝ ԴՆԹ պոլիմերազի կատալիզացման տակ՝ օգտագործելով մայր ԴՆԹ-ն որպես ձևանմուշ և հատուկ պրայմերներ՝ որպես ընդլայնման մեկնարկային կետ: Դենատուրացիայի, եռացման, երկարացման և այլնի քայլերի միջոցով դուստր շղթայի ԴՆԹ-ի in vitro վերարտադրման գործընթացը, որը լրացնում է մայր շղթայի ձևանմուշ ԴՆԹ-ին, կարող է արագ և հատուկ ուժեղացնել ցանկացած թիրախային ԴՆԹ in vitro:

1. Hot Start PCR

Պայմանական PCR-ում ուժեղացման մեկնարկի ժամանակը PCR մեքենան PCR մեքենայի մեջ դնելը չէ, այնուհետև ծրագիրը սկսում է ուժեղանալ:Երբ համակարգի կազմաձևումն ավարտված է, սկսվում է ուժեղացումը, որը կարող է առաջացնել ոչ հատուկ ուժեղացում, և թեժ մեկնարկով PCR-ն կարող է լուծել այս խնդիրը:

Ի՞նչ է տաք մեկնարկ PCR-ը:Ռեակցիոն համակարգի պատրաստումից հետո ֆերմենտային փոփոխիչն ազատվում է բարձր ջերմաստիճանում (սովորաբար 90°C-ից բարձր) ռեակցիայի սկզբնական տաքացման փուլում կամ «տաք մեկնարկի» փուլում, որպեսզի ԴՆԹ պոլիմերազը ակտիվանա:Ակտիվացման ճշգրիտ ժամանակը և ջերմաստիճանը կախված են ԴՆԹ պոլիմերազի և տաք մեկնարկի փոփոխիչի բնույթից:Այս մեթոդը հիմնականում օգտագործում է մոդիֆիկատորներ, ինչպիսիք են հակամարմինները, մերձեցման լիգանները կամ քիմիական մոդիֆիկատորները՝ ԴՆԹ պոլիմերազի ակտիվությունը արգելակելու համար:Քանի որ ԴՆԹ պոլիմերազի ակտիվությունը արգելակվում է սենյակային ջերմաստիճանում, տաք մեկնարկի տեխնոլոգիան մեծ հարմարավետություն է ապահովում սենյակային ջերմաստիճանում բազմակի PCR ռեակցիայի համակարգերի պատրաստման համար՝ առանց վնասելու PCR ռեակցիաների առանձնահատկությունը:

2. RT-PCR

RT-PCR (Reverse transcription PCR) փորձարարական մեթոդ է mRNA-ից cDNA հակադարձ տրանսկրիպցիայի և որպես ուժեղացման ձևանմուշ օգտագործելու համար:Փորձարարական պրոցեդուրան այն է, որ սկզբում արդյունահանվի ընդհանուր ՌՆԹ-ն հյուսվածքներում կամ բջիջներում, օգտագործվի Oligo (dT) որպես այբբենարան, օգտագործվի հակադարձ տրանսկրիպտազ՝ cDNA սինթեզելու համար, այնուհետև օգտագործվի cDNA՝ որպես PCR ամպլիֆիկացիայի ձևանմուշ՝ թիրախ գենը ստանալու կամ գենի արտահայտությունը հայտնաբերելու համար:

3. Լյումինեսցենտային քանակական PCR

Լյումինեսցենտային քանակական PCR (իրական ժամանակի քանակական PCR,RT-qPCR) վերաբերում է PCR ռեակցիայի համակարգին լյումինեսցենտային խմբերի ավելացման մեթոդին, օգտագործելով լյումինեսցենտային ազդանշանների կուտակումը՝ իրական ժամանակում ամբողջ PCR գործընթացը վերահսկելու համար, և վերջապես օգտագործելով ստանդարտ կորը՝ կաղապարը քանակապես վերլուծելու համար:Սովորաբար օգտագործվող qPCR մեթոդները ներառում են SYBR Green I և TaqMan:

4. Nested PCR

Nested PCR-ը վերաբերում է PCR պրայմերների երկու հավաքածուների օգտագործմանը PCR ուժեղացման երկու փուլերի համար, իսկ երկրորդ փուլի ուժեղացման արդյունքը թիրախ գենի հատվածն է:

Եթե ​​առաջին զույգ պրայմերների (արտաքին պրայմերների) անհամապատասխանությունը հանգեցնում է ոչ սպեցիֆիկ արտադրանքի ուժեղացմանը, ապա հավանականությունը, որ նույն ոչ սպեցիֆիկ շրջանը ճանաչվի երկրորդ զույգ պրայմերների կողմից և շարունակի ուժեղացնելը, շատ փոքր է, ուստի ուժեղացում երկրորդ զույգ պրայմերներով, PCR-ի առանձնահատկությունը բարելավվել է:PCR-ի երկու փուլերի կատարման առավելություններից մեկն այն է, որ այն օգնում է մեծացնել բավարար արտադրանքը սահմանափակ սկզբնական ԴՆԹ-ից:

5. Touchdown PCR

Touchdown PCR-ը PCR ռեակցիայի առանձնահատկությունը բարելավելու մեթոդ է՝ PCR ցիկլի պարամետրերը կարգավորելու միջոցով:

Touchdown PCR-ում առաջին մի քանի ցիկլերի համար եռացման ջերմաստիճանը մի քանի աստիճանով բարձր է պրայմերների եռացման առավելագույն ջերմաստիճանից (Tm):Զրման ավելի բարձր ջերմաստիճանը կարող է արդյունավետորեն նվազեցնել ոչ սպեցիֆիկ ուժեղացումը, բայց միևնույն ժամանակ, եռացման ավելի բարձր ջերմաստիճանը կխորացնի պրայմերների և թիրախային հաջորդականությունների բաժանումը, ինչը կհանգեցնի PCR-ի նվազման:Հետևաբար, առաջին մի քանի ցիկլերում կռելու ջերմաստիճանը սովորաբար սահմանվում է 1°C-ով մեկ ցիկլով նվազեցնելու համար՝ համակարգում թիրախային գենի պարունակությունը մեծացնելու համար:Երբ եռացման ջերմաստիճանը իջեցվում է օպտիմալ ջերմաստիճանի, եռացման ջերմաստիճանը պահպանվում է մնացած ցիկլերի համար:

6. Ուղղակի ՊՇՌ

Ուղղակի ՊՇՌ-ն վերաբերում է թիրախային ԴՆԹ-ի ընդլայնմանը ուղղակիորեն նմուշից՝ առանց նուկլեինաթթվի մեկուսացման և մաքրման անհրաժեշտության:

Ուղղակի PCR-ի երկու տեսակ կա.

ուղղակի մեթոդ. վերցնել փոքր քանակությամբ նմուշ և այն ուղղակիորեն ավելացնել PCR Master Mix-ին՝ PCR նույնականացման համար;

Cracking մեթոդ. Նմուշը նմուշառելուց հետո այն ավելացրեք լիզատի մեջ, լուծեք գենոմը ազատելու համար, վերցրեք մի փոքր քանակությամբ լիզված գերնույն նյութ և ավելացրեք այն PCR Master Mix-ին, կատարեք PCR նույնականացում:Այս մոտեցումը պարզեցնում է փորձարարական աշխատանքի ընթացքը, նվազեցնում է գործնական ժամանակը և խուսափում է ԴՆԹ-ի կորստից մաքրման քայլերի ընթացքում:

7. SOE PCR

Գենի զուգավորումը համընկնման ընդլայնման PCR-ով (SOE PCR) օգտագործում է լրացուցիչ ծայրերով պրայմերներ, որպեսզի PCR արտադրանքները ձևավորեն համընկնող շղթաներ, այնպես որ հետագա ուժեղացման ռեակցիայում, համընկնող շղթաների երկարացման միջոցով, A տեխնիկայի տարբեր աղբյուրներ, որոնցում ուժեղացված բեկորները համընկնում են: և միաձուլված:Այս տեխնոլոգիան ներկայումս ունի երկու հիմնական կիրառման ուղղություն՝ միաձուլման գեների կառուցում;գենի կայքի ուղղորդված մուտացիա.

8. IPCR

Հակադարձ PCR (IPCR) օգտագործում է հակադարձ կոմպլեմենտար պրայմերներ՝ երկու այբբենարաններից բացի այլ ԴՆԹ-ի բեկորներն ուժեղացնելու համար և ուժեղացնում է անհայտ հաջորդականությունները հայտնի ԴՆԹ-ի հատվածի երկու կողմերում:

IPCR-ն ի սկզբանե նախագծվել է հարակից անհայտ շրջանների հաջորդականությունը որոշելու համար և հիմնականում օգտագործվում է գեների խթանման հաջորդականությունները ուսումնասիրելու համար;օնկոգեն քրոմոսոմային վերադասավորումներ, ինչպիսիք են գեների միաձուլումը, տրանսլոկացիան և տրանսպոզիցիան;և վիրուսային գեների ինտեգրումը, որոնք սովորաբար օգտագործվում են նաև այժմ Կայքի ուղղորդված մուտագենեզի համար պատճենեք պլազմիդը ցանկալի մուտացիայով:

9. dPCR

Թվային PCR (dPCR) նուկլեինաթթվի մոլեկուլների բացարձակ քանակական որոշման տեխնիկա է:

Ներկայումս նուկլեինաթթվի մոլեկուլների քանակական որոշման երեք մեթոդ կա.Ֆոտոմետրիան հիմնված է նուկլեինաթթվի մոլեկուլների կլանման վրա.իրական ժամանակի լյումինեսցենտային քանակական PCR (Իրական ժամանակում PCR) հիմնված է Ct արժեքի վրա, իսկ Ct արժեքը վերաբերում է ցիկլի համարին, որը համապատասխանում է ֆլյուորեսցենտային արժեքին, որը կարելի է հայտնաբերել.թվային ՊՇՌ-ն նորագույն քանակական տեխնոլոգիա է, որը հիմնված է նուկլեինաթթուների քանակական հաշվման միամոլեկուլային ՊՇՌ մեթոդի վրա, բացարձակ քանակական մեթոդ է: